好象是甲状腺亢奋的也容易瘦.
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rhQ 附录:血浆orexin-A（一种受觉醒刺激激活的神经肽）
69TQH J[ Orexin-A mRNA表达的脏器分布及在急性炎症反应中的变化
\oLRNr[F 来源:中国危重病急救医学2005年4月第17卷第4期;添加日期:2005-5-3;编辑:editor
wp$C J09f* 颜光涛 林季 廖杰
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#: 【摘要】 目的: 研究Orexin-A mRNA表达在体内主要脏器的分布及在急性炎症损伤后的变化，探讨Orexin-A在急性炎症反应中的作用。方法: 取正常雄性SD大鼠和肠缺血-再灌注（IR）损伤模型大鼠的下丘脑、胃、肺、肾、附睾脂肪垫、睾丸、肝、脾、十二指肠等主要脏器，采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测Orexin-A mRNA在各主要脏器的分布情况，同时检测IR损伤后下丘脑内Orexin-A mRNA的表达变化。结果: 所取各脏器均有Orexin-A mRNA表达，尤其是在胃、肺、肾的表达丰度较高。在IR损伤的急性刺激作用后，下丘脑Orexin-A mRNA表达水平出现波动式的下降趋势。结论: Orexin-A mRNA广泛分布于机体主要脏器，对急性炎症刺激具有时间依赖性的应答效应，其表达水平变化可以作为一种新型的急性炎症反应监测指标。
~'=s?\I D=o9+5Slw 【关键词】 Orexin-A mRNA； 缺血-再灌注损伤,肠； 逆转录-聚合酶链反应
C3hnX2"; 3m Distribution of Orexin-A mRNA expression in different organs and its variation in acute inflammation
N:\I]M D />REC^ YAN Guang-tao, LIN Ji, LIAO Jie.??
N1zB; -0t 8yA : C Research Laboratory of Biochemistry, General Hospital of PLA, Beijing 100853, China
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= 【Abstract】 OBJECTIVE:：To explore the distribution of Orexin-A mRNA expression in different organs, and its variation in acute inflammation, and to evaluate the role of Orexin-A in acute inflammatory responses. METHODS:：Hypothalamus, adipose tissue, lung, stomach, duodenum, liver, spleen and testis of male Sprague-Dawley rats (including normal and those of intestinal ischemia/reperfusion injury model) were harvested, and reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) was used to assess Orexin-A mRNA expression in different tissues of normal rats, and that in the hypothalamus of ischemia/reperfusion injured rats. RESULTS: All tissues expressed Orexin-A mRNA, and it was especially high in the stomach, lung and kidney. After the acute stimulus of ischemia/reperfusion injury, Orexin-A mRNA expression showed a trend of fluctuant declination in the hypothalamus. CONCLUSION:：Orexin-A mRNA is widely expressed in the major organs, and it has a time-dependent response to acute inflammatory stimuli. The results suggest that its expression variation may be used as a novel marker for acute inflammation.
lm o>z'< Xc"S"a^\% 【Key words】 Orexin-A mRNA; intestinal ischemia/reperfusion injury; reverse transcription-polymerase chain reaction
<s)+V6 \E 03iO4yO u Orexin-A，亦称为hypocretin-1，是一种由下丘脑侧部特异神经元分泌的短肽。它由33个氨基酸残基组成，分子质量仅为3 562 ku，参与睡眠和能量稳态的调控过程，尤其与肥胖的发生及摄食行为密切相关，主要作用是刺激摄食和减少能量消耗〔1〕。在不同物种之间，其蛋白结构也具有很大程度的同源性，人Orexin-A的结构就与大鼠、小鼠及牛的完全一致〔2〕。近年来的研究表明，Orexin-A mRNA主要表达于下丘脑及周围脑组织，也有人在表皮及胃肠黏膜中发现少量Orexin-A mRNA〔3,4〕，但对其在机体主要脏器的分布情况尚无明确报道。
8'@ pX< W2qW`Ujo{ 肠缺血-再灌注（ischemia/reperfusion，IR）损伤是一种能很好反映急性炎症反应的模型，在损伤过程中机体会出现严重的能量代谢障碍和失控炎症反应。由于Orexin-A是一种主要由下丘脑分泌的与能量代谢密切相关的蛋白因子，我们推测Orexin-A可能参与了肠IR损伤等急性炎症反应所致能量代谢障碍的调控过程。为此，我们提取正常大鼠和肠IR损伤模型大鼠下丘脑、胃、肺、肾、附睾脂肪垫、睾丸、肝、脾、十二指肠等主要脏器，采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测?Orexin-A?mRNA在各主要脏器的分布情况，以及肠IR损伤后下丘脑Orexin-A mRNA的表达变化，以探讨Orexin-A mRNA表达在组织中的分布及其与急性炎症反应的关系，为今后进一步研究Orexin-A在急性炎症反应中的确切作用奠定了基础。
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*3O5m 1 材料与方法?
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HX0+ 1.1 材料：雄性成年SD大鼠60只，体重250 g，由解放军总医院实验动物中心提供。焦碳酸二乙酯（DEPC）、琼脂糖、溴乙啡啶购自Sigma?RO 公司；禽成髓细胞瘤病毒(AMV)逆转录酶、寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸〔Oligo（dT）15〕引物均购自Promega RO?公司；TRIzol试剂、Taq酶、dNTPs、β-actin引物均购自北京鼎国生物技术公司；Orexin-A引物由北京赛百盛基因技术公司合成；其他试剂均为市售国产分析纯。?
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UAPh 1.2 实验方法?
Dwe_ytjpc >A7),6 1.2.1 大鼠肠IR损伤模型的建立：54只存活大鼠被随机分成6组：假手术组（Sham），缺血60 min再灌注30 min（I60R30）、90 min(I60R90)、150 min(I60R150)、240 min(I60R240)和360 min?(I60R360)，每组9只。腹腔内注射质量分数为1%的戊巴比妥钠1.5 ml（60 mg/kg）麻醉，无菌条件下开腹并分离肠系膜上动脉(SMA)，以微动脉夹夹闭60 min，然后取出微动脉夹进行再灌注〔5〕。?
uhbo/7d'7 Fpzps!(;= 1.2.2 各脏器组织样品的制备：假手术组大鼠麻醉后取各组织标本；IR各实验组大鼠依据不同时间点取各组织标本。组织标本置液氮中速冻后，转移到?-80 ℃?保存。?
[XhuJdr "u .~4%TsBa Y 1.2.3 总RNA的提取以及RT反应：采用?TRIzol?试剂提取各组织的总RNA，具体操作步骤按北京鼎国生物技术公司提供的说明书进行。提取总RNA后，以三蒸水作为空白对照，测量样品在?260 nm?处的吸光度值(Ａ值)并计算总RNA浓度。RT体系（20 μl）包括：2.5 μg总RNA，40 U AMV逆转录酶，1 μg Oligo?（dT）15引物，4 μl 5×逆转录缓冲液,1 mmol/L dNTPs,20 U RNA酶抑制剂及质量分数为0.1%?的DEPC处理灭菌水。将ＲＴ样品置于37 ℃?水浴2 h，然后95 ℃水浴5 min以灭活AMV酶，快速冰镇并在4 ℃下，10 000×g离心5 min，保存cDNA样品于-20 ℃〔6〕。?
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6 |j#x}8 [( 1.2.4 PCR和图像处理：以β-actin mRNA水平作为cDNA合成及PCR的内源性参照。?Orexin-A? PCR体系（50 μl）包括：4 μl cDNA,0.5 μmol/L上游及下游引物,0.8 mmol/L dNTPs、2 U Taq酶,5 μl 10×PCR缓冲液（含20 mmol/L MgCl2）及灭菌去离子水。β-actin PCR反应体系同Orexin-A，除了其上、下游引物各为0.2 μg。反应所用的引物序列及条件见表1。Orexin-A引物序列参考Johren等〔7〕介绍的方法。表1中PCR反应条件的字母缩写所代表的意义如下：P（pre-degeneration）为预变性，D（degeneration）为变性，A（anneal）为退火，E（elongation）为延伸，C（cycle）为循环数。用质量分数为1.5%的琼脂糖凝胶（含0.5 mg/L溴乙啡啶）电泳检测PCR产物，并用Gel-Pro?RO凝胶分析仪拍摄电泳图像，并根据仪器提供的分析软件进行图像处理。?
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E cRDjpc] 2 结 果?
5E+l5M* ( ;.'2ZNt2 2.1 Orexin-A mRNA在各脏器中的分布(图1)：Orexin-A mRNA在下丘脑、胃、肺、肾、附睾脂肪垫、睾丸、肝、脾、十二指肠等脏器中均有表达，尤其是胃、肺和肾的表达丰度较高。
^mm:u<Yt oJvF)d@gU 2.2 损伤后下丘脑Orexin-A mRNA表达水平的比较(图2)：与损伤后Sham组下丘脑Orexin-A mRNA水平相比，I60R30组和I60R90组均有所降低，I60R150组最低，I60R240组和I60R360组逐步回升，但仍低于Sham组的水平。?
+8 ]}'6m @ {j'Pf' 3 讨 论?
=X2 Ieb l5l: 'EY> Orexin包含Orexin-A和Orexin-B两种成分，亦称为hypocretin-1和hypocretin-2。目前研究较多的是Orexin-A，但对它的研究几乎都局限在Orexin-A与肥胖、摄食、睡眠觉醒周期以及激素分泌等方面〔8〕。尽管Orexin-A具有多样化的功能，其受体也广泛分布于体内各器官〔9〕，但目前对?Orexin-A? mRNA的组织分布尚缺乏详细的报道。本研究结果显示，Orexin-A mRNA广泛表达于体内主要脏器，提示Orexin-A在机体的各种生命活动中发挥着重要作用。肠IR损伤模型是一种经典的创伤、感染和应激反应模型，通过夹闭SMA引发动物肠缺血、坏死，致使大量内毒素和氧自由基进入血液循环，并且激活全身单核/巨噬细胞和中性粒细胞，释放大量炎症介质和细胞因子，引发严重的全身性炎症反应和能量代谢障碍，甚至脓毒症和多器官功能衰竭〔10〕。同时体内交感、副交感神经系统活化引起儿茶酚胺、肾上腺皮质激素等物质急剧增加，血糖水平也发生改变，机体通过中枢神经和内分泌系统调节和加强各脏器的功能和代谢，稳定内环境〔11,12〕。有研究报道，Orexin-A与儿茶酚胺、糖皮质激素、血糖、交感神经系统兴奋性有一定联系〔13-16〕，说明?Orexin-A?在肠IR损伤等急性炎症反应能量代谢障碍中可能起一定作用。?目前国内外尚无关于Orexin-A与急性炎症反应相关联的确切报道。肠IR损伤对下丘脑组织Orexin-A mRNA表达水平的影响受到能量代谢状态、血浆Orexin-A水平变化及麻醉作用的多重影响。在IR早期（从I60R30到I60R150），高代谢状态使血浆Orexin-A水平升高〔15〕，产生负反馈信号，同时麻醉剂抑制下丘脑神经元的活性〔17〕，下丘脑神经元内Orexin-A mRNA表达受到抑制而逐步下降；之后，高代谢状态逐步恢复，其促进血浆Orexin-A水平升高的作用减弱，同时麻醉剂对下丘脑神经元活性的抑制也减弱，于是Orexin-A mRNA的表达水平受负反馈影响而呈逐步回升趋势（从I60R240到I60R360）。Orexin-A在下丘脑组织内基因表达水平的波动式变化和整体的下降趋势，提示Orexin-A在IR损伤过程中可能起到一定的炎性细胞因子作用，即当机体处于炎症反应状态时，该细胞因子表达水平受到机体自身反馈调节的抑制，以使机体免遭进一步的损害。通过上述实验结果我们可以看出，Orexin-A mRNA广泛分布于机体主要脏器，其水平受中枢神经系统的调控。Orexin-A在急性炎症反应中产生有限的变化，对肠IR损伤等急性炎症刺激具有较迟缓的应答，表明其可能在损伤所致能量代谢障碍中发挥一定的炎性细胞因子作用。若能进一步证实Orexin-A是一种新型的炎症介质，对于临床危重病急救医学和新药研发将有巨大的推动作用。?
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{*bXO8vi(( 7[[ XNJP 作者单位：100853 北京，解放军总医院生化研究室(颜光涛，林季)；解放军总医院仪器测试中心(廖杰)
S^]i Z,.*!S=?h 作者简介：颜光涛(1960-)，男(汉族)，四川省宜宾市人，研究员，博士研究生导师
N1jj\.nB fT!n* ;h 重度OSAHS患者经CPAP治疗后血浆Orexin-A增高
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Y *WL 既往的研究发现血浆orexin-A（一种受觉醒刺激激活的神经肽）的减少程度与阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合症（OSAHS）的严重程度相平行。近期，日本学者Shigeru Sakurai等就CPAP治疗对OSAHS患者orexin-A的影响做了研究。该项研究包括了27名经CPAP治疗3－6个月的OSAHS患者（AHI 20）。根据AI（觉醒指数）分为2组： A 组（n = 11）， 60； B组 （n = 16）， < 60.在CPAP治疗前后分别采集血样标本测定orexin-A的浓度。结果发现：27名患者血浆orexin-A 浓度在CPAP治疗前与AI （r = –0.807； p < 0.0001）和AHI （r = –0.661； p < 0.0001）呈负相关。 A组的平均血浆orexin-A浓度（1.0 ± 0.3 pmol/L） 高于 B组 （4.6 ± 0.4 pmol/L）。经CPAP治疗后A组的平均血浆orexin-A浓度明显增加（达到 3.4 ± 1.2 pmol/L； p = 0.0069），但在B组并未增加。A组的CPAP治疗后血浆orexin-A 浓度增加程度与AI及Epworth睡眠评分的改善程度相平行。据此作者认为：重度OSAHS患者的低的血浆orexin-A 水平在CPAP治疗后增加，提示orexin-A 是一个反映OSAHS严重程度及治疗反应的血浆标志物。
